Fakultet: Biologia Molekularna

KOMPUTEROWA ANALIZA SEKWENCJI

Współczesna biologia dostarcza ogromnej ilości informacji, których przechowywanie i obróbka możliwa jest wyłącznie przy pomocy komputerów. Najistotniejszym obecnie narzędziem jest przeszukiwanie publicznych baz sekwencji DNA i białkowych. Bazy te zawierają wszystkie opublikowane sekwencje, w tym te pochodzące z projektów sekwencjonowania genomów. Przeszukanie baz sekwencji pozwala na stawianie hipotez na temat funkcji nowo sklonowanego genu. Przeszukiwanie bazy sekwencji polega na porównaniu zadanej sekwencji ze wszystkimi w bazie i wybraniu grupy najpodobniejszych. Istnieje wiele algorytmów porównujących, spośród których najpowszechniej stosowane są BLAST (szybki, ale mało czuły) oraz FASTA (wolniejszy i bardziej czuły).

Wielu informacji może dostarczyć analiza samej sekwencji. Istnieją narzędzia pozwalające na identyfikację domen białkowych w sekwencji. Potężnym narzędziem jest analiza filogenetyczna.

Eksperyment, na którym oparte są nasze tegoroczne ćwiczenia, polega na analizie genu SC5316(dehydrogenazy alkoholowej drugiej) pod kątem przeklonowania do konstruktu pCAMBIA. Następnie spróbujemy powiedzieć coś o funkcji genu SC5316 analizując jego domeny i robiąc wstępną analizę filogenetyczną.

Wykonanie:

1. Przeszukiwanie bazy artykułów naukowych.

• połącz się ze stroną http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/

• w bazie PubMed znajdź artykuły autorstwa promotora Twojej pracy licencjackiej

• znajdź kilka artykułów na dowolny interesujący Cię temat, przejrzyj streszczenia

2. Znalezienie sekwencji promotora genu dehydrogenazy alkoholowej w bazie danych

• na stronie http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ w bazie sekwencji nukleotydowych znajdź szukany gen posługując się jego numerem (accession number) XM_712556-w sekwencji.

3. Wybór miejsc restrykcyjnych do klonowania genu

• połącz się ze stroną http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/

• wklej sekwencję promotora, przeprowadź analizę miejsc restrykcyjnych

• znajdź w bazie sekwencję plazmidu pCAMBIA-1381Z i wykonaj analizę restrykcyjną

• wybierz enzymy restrykcyjne do klonowania genu

4. Projektowanie starterów do PCR do klonowania genu

• połącz się ze stroną http://primer3.arabidopsis.pl

• wklej sekwencję promotora, ustaw odpowiednie parametry projektowania starterów

• wybierz i zanotuj najlepszą parę

5. Analiza sekwencji genu dehydrogenazy alkoholowej

• znajdź sekwencję białka kodowanego przez gen SC5314

• połącz się ze stroną http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ wybierz program BlastP

• wklej sekwencję i rozpocznij przeszukiwanie

• dokładnie przyjrzyj się znalezionym sekwencjom

• postaw hipotezę na temat funkcji genu SC5316

• przeprowadź analizę domen obecnych w białku SC5316 przy pomocy serwisu SMART http://smart.embl-heidelberg.de/ oraz CDART http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/

• zweryfikuj hipotezę na temat funkcji SC5316

6. Prosta analiza filogenetyczna

• przeszukaj bazę sekwencji programem BLAST

• kilka sekwencji znalezionych w punkcie pierwszym zapisz w jednym pliku w formacie Fasta

• otwórz plik z sekwencjami w programie ClustalX (dostępny ze strony http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalX/)

• stwórz dobry multiple alignment – porównanie kilku sekwencji

• oblicz drzewo filogenetyczne sekwencji

• obejrzyj drzewo programem NJplot

• dokładnie przeanalizuj otrzymane drzewo pamiętając, że jest to drzewo nieukorzenione